体外抗氧化及细胞保护作用评价方法对不同黑茶提取物功能性成分分析及活性评价

  在回到家乡的这几年中,我看到或听到的许多宣传安化黑茶的种种奇说,除了安化黑茶的九大功效外,近来还“诞生”了安化黑茶的二十大功效。但这些奇说的理论基础是什么?有何数据可以作为支撑?在长期的饮用过程中消费者的实际体验如何?应该用什么方法来进行科学的、有效的、总结与推介?还没有一家企业或大伽真正能够作出科学的回答。当然,这是一个很大的课题,不是任何一个人或者一家科研机构能够简单回答的。但从海量的数据库中对相关的研究进行梳理、总结、综述,应当看作是一种或可行的方法。

  安化黑茶在我国的六大茶类中,的确是具有特殊性的、药理与营养功能突出的一种茶类。要正确地宣传推广安化黑茶,我们应当本着科学、实事求是的态度用科学研究数据与实际体验数据来说话。

  以采用体外抗氧化及细胞保护作用评价方法(DPPH法、ORAC荧光法以及PC12细胞损伤保护实验)研究不同黑茶(安化黑茶、普洱茶、六堡茶)提取物的功能活性,并将其活性指标与功能性成分的组成及含量进行了相关性分析的研究课题为例。现将相关的试验数据与研究结论摘要发表如下,以供安化黑茶的企业家们、销售商们参考。
由表1可知,不同黑茶提取物的得率具有显著性差异(P<0.05),得率从高到低排序为普洱茶>天尖茶>六堡茶>茯砖茶>百两茶,其中得率最高为普洱茶(33.25%),百两茶得率最低(18.55%),仅为普洱茶55.8%。黑茶提取物的组成成分中,茶多酚含量最高,茶多糖及咖啡碱次之,没食子酸、蛋白质和氨基酸含量较少。5种黑茶提取物中茶多酚含量最高(261.45~373.77mg/g),含量从高到低排序为:天尖茶>百两茶>茯砖茶>六堡茶>普洱茶。其中湖南产区的3种黑茶提取物中多酚含量显著高于云南普洱及广西六堡茶(P<0.05),天尖茶提取物多酚含量最高(373.77mg/g),含量最低的为普洱茶(261.45 mg/g)。茶叶多酚类物质是茶叶中主要的功能性活性成分,随着茶叶存放时间延长茶多酚含量不断下降,从而使得黑茶涩味降低,口感醇和。茶多酚含量还与原料的老嫩程度及品种有一定关系,同为湖南产区的3 种黑茶,天尖茶一般采用安化一、二级黑毛茶加工制成,原料较嫩,多酚含量较高,而砖茶、方包茶中茶梗较多,多酚含量则相对偏低。

  5种黑茶提取物茶多糖含量范围为72.31~138.88 mg/g,差异显著,含量从高到低排序为茯砖茶>百两茶>天尖茶>普洱茶>六堡茶。茯砖茶提取物含糖量最高(138.88mg/g),与其生产过程中特殊的发花工艺有关,工艺产生的冠突散囊菌分泌大量的酶,同时该菌的分泌液可激活酶类的活性,促进大分子分解和小分子络合,从而进一步提高可溶性糖类的含量。钟兴刚等采用体积分数80%乙醇回流提取两类安化黑茶茶多糖,也发现茯砖茶和天尖茶的茶多糖平均含量高,且茯砖茶高于天尖茶。
  黑茶提取物中普洱茶提取物咖啡碱含量最高(117.41mg/g),显著高于其余4 种黑茶提取物(80.58~98.36 mg/g)。咖啡碱是茶叶的主要呈味物质和生理活性成分,是黑茶渥堆过程中微生物的氮源之一,但由于其嘌呤碱杂环结构难以被破坏,所以在茶叶中含量较稳定。黑茶提取物中没食子酸、蛋白质及氨基酸含量相对较少。普洱茶中没食子酸含量最高,显著高于其他茶类(18.03~39.24 mg/g),达64.16 mg/g。没食子酸是茶多酚的重要组成单元,在普洱茶中含量较高,是普洱茶的一个具有生理活性的、特征性简单酚类化合物。天尖、茯砖和百两茶提取物的蛋白质含量比普洱茶及六堡茶高,但总体差异不大。5种黑茶提取物中游离氨基酸含量规律与没食子酸含量规律相似,同样是普洱茶提取物最高(23.82 mg/g),百两茶最低(9.50 mg/g),且普洱茶提取物中含量显著高于3种湖南黑茶提取物。
表 2 不同黑茶提取液儿茶素组分含量Table 2 Catechin composition of tea extracts
注:“酯/简”表示酯型儿茶素含量与简单儿茶素含量的比值;儿茶素含量表示为每克干物质中的所含物质质量;同列肩标字母不同表示数据间存在显著性差异(P<0.05)。
  采用高效液相法对5种黑茶提取物中主要的几种儿茶素进行定量分析,结果如表2所示。天尖、茯砖、百两茶提取物中儿茶素的总量(161.53~200.17mg/g)显著高于普洱茶(65.39mg/g)和六堡茶(71.85 mg/g),其中天尖茶提取物儿茶素总量最高(200.17 mg/g),是普洱茶提取物(65.39 mg/g)中的3倍。儿茶素是茶叶多酚类物质的主体成分,约占茶多酚总量的70%~80%,研究结果也发现,总酚含量与儿茶素总量具有显著相关性(P<0.05),相关系数达0.932。有研究表明黑茶在渥堆过程中,多酚类含量逐渐降低,形成大量的茶褐素,儿茶素总量变化趋势与茶多酚一致,其含量对黑茶汤色品质形成至关重要。儿茶素可分为酯型儿茶素和简单儿茶素,酯型儿茶素具有较强的保健功能,其中又以EGCG和ECG的活性较高,具有抗肿瘤、抗氧化、保护神经系统、保护心脑血管、免疫内分泌、代谢酶干预等作用,

  因此,酯/简比值越高其相关功能性越强。天尖、茯砖和百两茶儿茶素总量以酯型儿茶素为主,酯/简比值均大于1,其中百两茶比值最高(酯/简值为1.92),而六堡和普洱茶该比值都小于1。
表 3 不同品种茶叶提取液清除率DPPH自由基的IC50值
Table 3 IC50 valuesof different dark tea extracts for scavenging DPPHfree radicals
注:茶提取液和Trolox对DPPH自由基清除的IC50值以每1 mL原液中所含干物质含量表示,单位为μg/mL;同列肩标字母不同表示数据间存在显著性差异(P<0.05)
  5种黑茶提取液的DPPH自由基的IC50见表3。提取液质量浓度与其对DPPH自由基的清除作用存在良好的线性关系(相关系数为0.992~0.998),不同黑茶提取物的IC50值存在显著性差异(P<0.05)。百两、天尖及茯砖茶提取物的DPPH自由基清除能力显著高于对照组Trolox,而普洱和六堡茶的自由基清除能力则显著(P<0.05)低于对照组。百两茶提取物的IC50值最低(10.00μg/mL),广西六堡茶最高(18.70μg/g)。

  因此,不同黑茶提取物对DPPH自由基清除能力,按强弱依次排序为百两茶>茯砖茶>天尖茶>普洱茶>六堡茶。
表 4 茶提取液中主要功能性成分含量与体外活性能力的相关系数
Table 4 Correlationanalysis of the major functional components in
different dark teaextracts with antioxidant activity in vitro
注:*. P<0.05,差异显著;**. P<0.01,差异极显著。
  茶多酚含量与茶叶提取物对DPPH及ORAC值呈显著正相关(P<0.05),相关系数分别为0.925及0.914,表明茶多酚含量越高,黑茶提取物对自由基的清除能力越强,这与周端等[26]的研究结果相符。其中,ORAC值与儿茶素中ECG含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.967;同时,DPPH活性与ECG、EGCG的含量也有一定相关性,相关系数分别为0.879(P<0.05)和0.836。ECG和EGCG均为酯型儿茶素,且儿茶素的酯简比与DPPH和ORAC值相关系数都大于0.8,说明酯/简比值越高其相关功能性越强,且酯型儿茶素(特别是ECG)的含量是5种黑茶提取物中影响DPPH及氧自由基清除能力的重要因素。茶多糖含量也与DPPH自由基清除活性呈显著正相关(P<0.05),表明茶多糖也对黑茶提取液的DPPH自由基清除活性具有一定影响。聂少平等采用清除DPPH自由基法评价茶叶多糖抗氧化活性,发现从不同茶叶中提取的茶多糖均具有DPPH自由基清除活性,而且不同产地、品种及提取方法得到的茶多糖清除DPPH自由基能力明显不同。此外,PC12细胞保护效果与黑茶提取物中茶氨酸的含量,具有一定正相关性,相关系数为0.862;即黑茶提取物中茶氨酸含量越高,其对谷氨酸造成PC12细胞损伤的保护能力越强。Di等也曾发现,L-茶氨酸可与N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid receptor,NMDA)受体结合,降低L-谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。然而,黑茶提取物对PC12细胞损伤的保护能力与ORAC和DPPH自由基的趋势并不相同,这可能与3种方法的作用机理不同有关。

  不同品种黑茶提取物的组分含量和功能活性差异显著。其中茶多酚含量最高(天尖茶>百两茶>茯砖茶>六堡茶>普洱茶),茶多糖(茯砖茶>百两茶>天尖茶>普洱茶>六堡茶)及咖啡碱次之,没食子酸、蛋白质和氨基酸含量较少。通过聚类分析发现,黑茶提取物的成分组成与茶叶产地有一定相关性,产自湖南的茯砖、百两和天尖茶提取物成分组成具有较高的相似度,而普洱与六堡茶则归为另外一类。茯砖、天尖和百两茶提取物对DPPH自由基清除及氧自由基吸收能力都比普洱及六堡茶强,而在PC12细胞损伤保护实验中,则是以茯砖、普洱及六堡茶提取物较为有效。其中,DPPH自由基清除率和ORAC结果与提取物中茶多酚含量和儿茶素酯简比具有明显相关性,表明酯型儿茶素(ECG和EGCG)的含量对DPPH及ORAC活性具有较大贡献,此外,DPPH活性也与茶多糖含量具有显著相关性。而与PC12细胞损伤保护效果呈现较高正相关的指标为黑茶提取物中茶氨酸的含量。

  本文所提供的案例以详实的研究分析数据充分地解析了安化黑茶的功能性特征,这些数据对于正确宣传推广黑茶的药理与营养功能有着科学的支撑与证明作用。所以,需要从事黑茶生产开发与销售的同仁们从数据中去多多领悟,多多学习,潜移默化,充实自己。只有这样,才能真正地为发展安化黑茶作出有益的工作。

华莱黑茶


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